胰酶使用注意及貼壁細(xì)胞的消化

胰酶使用注意：

1、在使用胰酶細(xì)胞消化液的過程中要特別注意避免消化液被細(xì)菌污染。

2、胰酶細(xì)胞消化液消化細(xì)胞時(shí)間不宜過長(zhǎng)，否則細(xì)胞鋪板后生長(zhǎng)狀況會(huì)較差。

貼壁細(xì)胞的消化：

1、吸去培養(yǎng)液，用無(wú)菌的PBS、Hanks液或無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞一次，以去除殘余的血清

2、加入少量胰酶細(xì)胞消化液，略蓋過細(xì)胞即可，根據(jù)胰酶效率差異可以增加惑減少胰酶用量。室溫放置30秒至2分鐘（不同的細(xì)胞消化時(shí)間有所不同）

3、顯微鏡下觀察，細(xì)胞明顯收縮，并且肉眼觀察培養(yǎng)器皿底部發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生明顯的變化呈白茫狀；或者用槍吹打細(xì)胞發(fā)現(xiàn)細(xì)胞剛好可以被吹打下來。

4、此時(shí)吸除胰酶細(xì)胞消化液。加入含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打下細(xì)胞，即可直接用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)如果發(fā)現(xiàn)消化不足，則加入胰酶細(xì)胞消化液重新消化。

如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞消化時(shí)間過長(zhǎng)，未及吹打細(xì)胞，細(xì)胞已經(jīng)有部分直接從培養(yǎng)器皿底部脫落，直接用胰酶細(xì)胞培養(yǎng)液把細(xì)胞全部吹打下來。1000-2000g離心1分鐘，沉淀細(xì)胞，盡量去除胰酶細(xì)胞消化液后，加入含血清的培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞，即可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

常用的細(xì)胞消化液為胰蛋白酶（Trypsin），EDTA等，其功能主要是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)（如細(xì)胞外基質(zhì)）水解，改變細(xì)胞間的連接，使組織或細(xì)胞片分散成單個(gè)細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。

影響消化速度的因素較多，主要有胰酶溶液的活性（配制條件、凍存或4℃保存時(shí)間長(zhǎng)短、是否反復(fù)凍融、化凍后存放時(shí)間及溫度等）、消化時(shí)的溫度（氣溫、細(xì)胞培養(yǎng)瓶及胰酶溶液的溫度）以及所加胰酶溶液的多少等 。

加入胰蛋白酶-EDTA溶液，視細(xì)胞瓶的大小加入體積為2ml或更多（依培養(yǎng)器皿的大小而定），以使充分浸潤(rùn)；

一般消化時(shí)間約為1至3分鐘，肉眼觀察瓶底由半透明（細(xì)胞單層連接成片）轉(zhuǎn)為透明、點(diǎn)狀（出現(xiàn)細(xì)小空隙）時(shí)，棄去細(xì)胞消化液，或看見培養(yǎng)瓶壁呈白茫狀即可。并加入適量的培養(yǎng)液終止消化，吹打分散；如見大量細(xì)胞片狀脫落，已消化過頭，則不能頃倒消化液而直接進(jìn)行下一步操作。（消化過頭，可造成大量細(xì)胞從瓶壁上脫下，甚至造成細(xì)胞破碎。由于血清含有非特異性胰蛋白酶抑制劑，所以加入培養(yǎng)基可以終止反應(yīng)。

胰酶配置方法：

1、培養(yǎng)液配制，方便好用，對(duì)細(xì)胞影響小，并且培養(yǎng)液的ph值正好適合胰蛋白酶的溶解

2、生理鹽水配制，要先調(diào)ph值7.2到7.4（①胰酶（1：250） 2.5 克②EDTA-Na 0.3克③NaCl 8.0克④KCl 0.4克⑤Glucose 1.0克⑥Phenol Red 0.005克⑦Water 1000 mL磁力攪拌2-3小時(shí)，調(diào)pH 7.8-8.0，過濾除菌。）

3、pbs（0.1%胰酶溶液的配制：稱取胰酶粉末0.1g，先用少許滅菌過的PBS調(diào)成糊狀，然后補(bǔ)足到100ml。置室溫?cái)嚢?小時(shí)或冰箱內(nèi)過夜，過濾滅菌，分裝，4℃保存?zhèn)溆谩＃? 或是hanks或是D-hanks液配制（1.稱取胰蛋白酶粉末置燒杯中，先用少許D-Hanks 平衡鹽溶液（pH7.2 左右）調(diào)成糊狀，然后再補(bǔ)足D-Hanks 平衡鹽溶液，攪拌混勻，置室溫4 小時(shí)或冰箱過夜，并不斷攪拌振蕩；2.次日，先用濾紙粗濾，再進(jìn)行過濾除菌，分裝入瓶中，低溫冰箱保存?zhèn)溆茫Ｓ脻舛葹?.25% 或0.125%。胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可調(diào)用碳酸氫鈉溶液調(diào)pH 至7.2 左右。）

一般0.45微米的一次性濾器過濾除菌，至于作用效果，需要消化一次細(xì)胞感覺一下，因?yàn)椴煌瑥S家的酶不一樣，有的作用溫和，有的作用劇烈。

4、是否需要四度放置過夜，取決于你的胰酶的純度。過去的胰酶純度不高，所以難以溶解，需要四度過夜. 而現(xiàn)在的胰酶純度都很高，就沒有必要四度過夜。從理論上來說，四度放置過夜，給細(xì)菌生長(zhǎng)的機(jī)會(huì)，盡管過濾可以出去細(xì)菌，可是出不掉其代謝產(chǎn)物。

胰蛋白酶不溶,有絮狀物的原因，考慮有：

1、過期或是酶已經(jīng)部分變性

2、溶液ph值不對(duì)

3、在沒過濾之前的絮狀沉淀是正常現(xiàn)象，因胰酶多取自動(dòng)物胰腺，沉淀為組織塊，過濾后即可